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PCR, PCR, PCR o cómo detectar SARS-COV-2

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Fecha de Publicación
2020/05/07
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Los virus son las entidades biol√≥gicas m√°s peque√Īas que existen. Son tan peque√Īas que su detecci√≥n se hace compleja. Afortunadamente, vivimos una √©poca ideal para estudiar microorganismos gracias al avance de t√©cnicas de biolog√≠a molecular y de secuenciaci√≥n de √°cidos nucleicos (ADN y ARN). Esto ha hecho, por ejemplo, que a mediados de marzo ya haya 174 genomas completos y parciales disponibles del virus SARS-COV-2 (virus que provoca el covid-19) para que los investigadores puedan entender m√°s sobre este nueva cepa que viene causando estragos a nivel mundial (8).
Uno de los aspectos m√°s importantes para poder ¬ęaplanar la curva¬Ľ es detectar quienes est√°n enfermos. Para ello, el Instituto de Salud P√ļblica (ISP) es el organismo oficial que valida y determina la existencia del virus en las personas enfermas. Existen decenas centros de salud donde se realiza el examen (7), pero esta cantidad de centros autorizados para realizar diagn√≥sticos debe aumentar de acuerdo con la demanda para realizar el diagn√≥stico de covid-19, sum√°ndose distintas Universidades del pa√≠s.
El examen que se realiza se llama RT-Q-PCR, una sigla rara que explicaremos a continuación:
La reacci√≥n en cadena de la polimerasa (PCR) es una de las t√©cnicas de biolog√≠a molecular m√°s utilizadas desde su establecimiento en 1986 por Kary Mullis (1). Por este descubrimiento recibi√≥ el Premio Nobel de Qu√≠mica en 1993 (2). Esta t√©cnica ya ha sido mencionada en nuestro post llamado ‚Äú¬ŅQu√© tan grande es tu genoma?‚ÄĚ (si quieren ver m√°s aplicaciones entre las tantas que tiene hoy en d√≠a). El objetivo de la t√©cnica de PCR es recrear el proceso de replicaci√≥n del ADN, pero in vitro. Es decir, realizar muchas copias de una secuencia de ADN (o tantas veces como sea necesario) para poder detectar su presencia, pero usando reactivos y equipos de laboratorio en lugar de una maquinaria celular (no nos referimos a su tel√©fono, obvio). Todas estas reacciones se realizan en tubitos min√ļsculos donde los investigadores manipulan vol√ļmenes muy peque√Īos (la unidad es microlitro, es decir 0.000001 litros) de materiales como DNA (o RNA), enzimas, nucle√≥tidos, agua y otros con pipetas de precisi√≥n especiales para manejar tales cantidades (micropipetas).
Como ya mencionamos, esta t√©cnica permite incrementar la cantidad de copias de un material gen√©tico espec√≠fico para an√°lisis posteriores. El (o ‚Äėla‚Äô) PCR aplicado a microorganismos (virus, bacterias, arqueas, hongos) se utiliza con bastantes fines, entre ellos saber si hay bacterias viviendo en los volcanes o identificar algunos pat√≥genos virales (3). Tambi√©n se usa para comparar procesos hist√≥ricos de estructura gen√©tica, o para estimar niveles de flujo gen√©tico contempor√°neo en animales y plantas (9). Para que vea su versatilidad.
Una de las caracter√≠sticas m√°s importantes de esta t√©cnica, es que no se necesitan grandes cantidades de material gen√©tico para obtener resultados confiables en cualquiera de sus aplicaciones, lo que significa que podemos trabajar con una peque√Īa muestra (yay!).
Fuente: GIPHY

¬ŅEntonces en qu√© se diferencia con otras siglas que se abrevian PCR?

Hay un examen m√©dico muy com√ļn conocido tambi√©n como PCR, cuya sigla es Prote√≠na C Reactiva que en medicina se utiliza como marcador de inflamaci√≥n no espec√≠fico (4). Tambi√©n se usa para abreviar paro cardiorrespiratorio.

Pero si el SARS-CoV-2 es un virus de ARN, entonces ¬Ņc√≥mo se realiza este test?

Si. El material gen√©tico de SARS-CoV-2 est√° compuesto de ARN. Para su an√°lisis se requiere primero ‚Äėextraer‚Äô esta mol√©cula desde el virus, para lo cual se usan reactivos qu√≠micos espec√≠ficos, en un proceso largo y a veces tedioso (a menos que lo haga un robot) que implica romper esta capa de grasa (l√≠pidos) que recubre la c√©lula viral para acceder a la mol√©cula de ARN, lavarla e intentar que quede lo m√°s pura posible. Esto, adem√°s debe hacerse con mucho cuidado porque el ARN se degrada f√°cilmente fuera del virus sin contar que la persona que est√° ejecutando la t√©cnica est√° expuesta directamente al √©l. (Nadie dijo que esto fuera f√°cil). En la actualidad existen muchos ‚Äėkits‚Äô comerciales que permiten hacer este proceso m√°s r√°pido, pero elevan los costos. Una cosa por otra.
Una vez que se obtiene ARN del virus, este debe transcribirse en ADN mediante un proceso llamado transcripci√≥n inversa o retrotransmisi√≥n (Pa' los amigos, pasar de ARN a ADN). Esto, ya que la enzima clave para la reacci√≥n de PCR (ADN polimerasa) requiere usar como ‚Äėtemplado‚Äô (molde) ADN en vez de ARN.
Esto se logra gracias al uso de una enzima llamada ¬ęTranscriptasa Reversa (o inversa)¬Ľ (¬°descubierta en virus!), la que tiene como funci√≥n sintetizar ADN a partir de una mol√©cula de ARN (5) como la del virus SARS-CoV-2. Es por eso que el examen incluye la sigla ‚ÄėRT‚Äô (del ingl√©s reverse transcription). Luego de obtenido este ADN, se pasa a la etapa siguiente que es el PCR propiamente tal.
Para llevar a cabo esta reacción se utilizan los mismos componentes que usa la célula para replicar ADN. En este caso, es una mezcla de reactivos entre los que destacamos los siguientes:
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Una enzima ADN polimerasa bacana que es capaz de trabajar de forma estable a altas temperaturas (que se obtuvo desde una bacteria term√≥fila aislada desde ambientes termales en el Parque Nacional Yellowstone), permitiendo que los distintos nucle√≥tidos (ACGT) se vayan ¬ępegando¬Ľ a su base complementaria en la reacci√≥n para poder replicar (o copiar) esta mol√©cula muchas veces. Esto se llama amplificar el ADN.
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Los partidores, cebadores o primers en ingl√©s, que son¬† secuencias de ADN cortas que se unen de manera complementaria a un segmento de ADN que se quiere detectar. Este punto es fundamental: es necesario conocer la secuencia del ARN del virus (su genoma) para poder dise√Īar los partidores espec√≠ficos para que solo detecten este virus y ning√ļn otro. As√≠ de sensible debe ser para estos fines. Como dec√≠amos al principio, esa secuencia ya existe y todo gracias a la colaboraci√≥n mundial entre cient√≠ficos. Recalcamos esto, porque no siempre es as√≠, depende del objetivo del estudio. Adem√°s, hay algunos llamados partidores ‚Äúuniversales‚ÄĚ que amplifican una secuencia objetivo en una gran diversidad de organismos, pero esa es harina de otro costal.
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Finalmente, para que el test sea a√ļn m√°s espec√≠fico, se usa una sonda, que es un pedazo corto de ADN que s√≥lo se puede pegar a la secuencia espec√≠fica que se est√° amplificando. La sonda tiene una mol√©cula que puede brillar y otra que le impide brillar. Cuando la polimerasa incorpora a la sonda en la nueva mol√©cula de ADN, se libera el agente que permite brillar y que empieza a emitir luz fluorescente (6) y el tubito ¬ę¬°brilla!¬Ľ. Si este brilla, lo que quiere decir es que en esa muestra hay ADN viral de SARS-CoV-2 ¬†espec√≠ficamente. Y, por lo tanto, el examen es positivo.
El PCR y el RT-PCR han sido muy √ļtiles para el estudio de virus que generan enfermedades infecciosas, sobretodo en el diagn√≥stico de virus nuevos o emergentes como SARS-CoV-2 (6). Los aspectos te√≥ricos generales del PCR son bastante simples. Antiguamente, incluso se hac√≠an experimentos de PCR simplemente cambiando el tubito con los reactivos de un recipiente termorregulado a otro de temperatura distintas.
El primer paso de la reacci√≥n consiste en separar las dos hebras de ADN (o desnaturalizar las prote√≠nas, si usted es un √Īo√Īo sin remedio) y eso ocurre in vitro (en un tubito) a altas temperaturas. Los dos pasos siguientes son a temperaturas un poco m√°s bajas, pero a√ļn muy superiores a la temperatura del cuerpo, para que el ADN se quede estiradito, los partidores o cebadores encuentren y se ¬ępeguen¬Ľ a su secuencia objetivo y permita a la polimerasa copiar r√°pidamente agregando nucle√≥tidos como una campeona. Por eso usamos la polimerasa sacada de bacterias que vivir√≠an felices en los g√©iseres del Tatio (Taq polimerasa, desde una bacteria llamada Thermophilus aquaticus).
Los equipos que permiten hace el PCR se llaman termocicladores, un nombre complejo para un equipo que en la práctica, su función principal es solo cambiar la temperatura del tubito con los reactivos, pero de manera muy rápida y controlada.
Los termocicladores m√°s modernos que se usan para diagnosticar covid-19 detectan luz y se pueden programar. Ac√° describimos como ejemplo un programa para detectar SARS-CoV-2.

EN RESUMEN (Si se quiere lucir en su almuerzo online del domingo)

Primera Etapa:
Usar la transcriptasa reversa para transformar el ARN a ADN (RT) por 15 minutos, seguido de temperatura alta (95 C por 2 minutos) para separar y estirar las moléculas de ADN. Luego el programa repite un mismo ciclo que tiene dos pasos:
Segunda etapa:
1.
Temperatura alta (95 C por 2 minutos) para separar y estirar las nuevas moléculas de ADN que se van formando.
2.
Temperatura para que los partidores se ¬ępeguen¬Ľ a su secuencia objetivo enzima polimerasa trabaje sintetizando o replicando nuevo ADN (50-60¬ļ C por 55 segundos). A esta temperatura se pegan los partidores espec√≠ficos para SARS-CoV-2 que luego gu√≠an a la polimerasa y se pega la sonda espec√≠fica para SARS-CoV-2.
Cuando se termina el ciclo de temperaturas de la segunda etapa, se empieza de nuevo (por eso es un ¬ętermo-ciclador¬Ľ).
Cada vez que se repite este ciclo se genera m√°s ADN y mas sonda ¬ębrillante¬Ľ que se puede medir a medida que se acumula. Cuando una muestra tiene poco ADN, la luz se demora m√°s en ser suficiente para ser medida, por el contrario, en una muestra con mucho ADN (que viene de un paciente con mucha carga viral, por ejemplo) la luz se genera m√°s r√°pido. De esta manera podemos cuantificar el ADN y por eso en la sigla aparece la Q (por ¬ęquantitative¬Ľ en ingl√©s) porque la luz es proporcional al n√ļmero de copias del gen de inter√©s, y se puede obtener adem√°s un n√ļmero estimado de las part√≠culas virales presentes en el paciente.¬† Los protocolos espec√≠ficos para realizar esta reacci√≥n para detectar SARS-CoV-2 est√°n disponibles p√ļblicamente.
La reacción es tan específica para el virus, que si se puede detectar luz, la muestra analizada se considera positiva para SARS-CoV-2.
Por el momento es la forma más certera de diagnosticar covid-19 y la recomendada por la Organización Mundial de la Salud.
As√≠ que ya sabe: detectar la presencia de este virus no es cosa de poner una gotita de muestra y esperar a que una tira de papel cambie de color. Hay que ir a mirar su mol√©cula y encontrarle el parecido a las fotos del genoma bajo el texto ¬ęse busca¬Ľ, del escurridizo SARS-CoV2.

Bonus Track

Busque los errores de este texto:
Esta es una declaración de una autoridad de cuyo nombre no queremos acordarnos.
Solución de la sopa de letras (o Ud. no lo diga)
1.
No se dice que el gen del virus es positivo: se dice que se detectó la presencia del genoma viral o simplemente que el test es positivo
2.
No es correcto decir que se cultiva el gen: diga mejor que se amplificó el gen.
3.
Gen inactivo: no hay genes inactivos, hay virus activos o inactivos. Aunque tiene raz√≥n que el test no dice si el virus est√° activo (que puede infectar) o no, solo detecta que hay RNA de virus en la muestra.¬† Para saber si un virus est√° activo se puede cultivar (y de ac√° debe venir la confusi√≥n), pero ese es un proceso largo y t√©cnicamente dif√≠cil que no se puede usar con el n√ļmero de contagiados por SARS-CoV2. Es mejor asumir que un test positivo indica que la persona a√ļn puede contagiar. Recordemos que un PCR para detectar SARS-CoV2, usa secuencias espec√≠ficas del genoma viral, por lo que s√≥lo detectar√° la presencia de este virus en espec√≠fico y no otro.
Y recuerden, l√°vense las manos, mantenga su distancia social, intente quedarse en casa lo m√°s que pueda. Es un consejo de tus amigues de Etilmercurio

Referencias

1.
Mullis, K., Faloona, F., Scharf, S., Saiki, R., Horn, G., & Erlich, H. (1986). Specific Enzymatic Amplification of DNA In Vitro: The Polymerase Chain Reaction. Cold Spring Harbor Symposia On Quantitative Biology, 51(0), 263-273. doi: 10.1101/sqb.1986.051.01.032 Disponible aquí.
2.
The Nobel Prize in Chemistry 1993. (2020). Retrieved 19 March 2020, Disponible aquí.
3.
Clinical Application of Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction for HIV Infection Holodniy, Mark, Clinics in Laboratory Medicine, Volume 14, Issue 2, 335 - 349 Disponible aquí.
4.
Pepys, M., & Hirschfield, G. (2003). C-reactive protein: a critical update. Journal Of Clinical Investigation, 112(2), 299-299. doi: 10.1172/jci18921c1. Disponible aquí.
5.
Bustin, S. (2000). Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. Journal Of Molecular Endocrinology, 25(2), 169-193. doi: 10.1677/jme.0.0250169 Disponible aquí.
6.
Mackay, I. (2002). Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Research, 30(6), 1292-1305. doi: 10.1093/nar/30.6.1292 Disponible aquí.
7.
Carvallo, C., 2020. Cómo Es El Procedimiento Y Protocolo Del ISP Para Detectar Casos De Coronavirus En Chile | Emol.Com. [online] Emol. Disponible aquí [Accessed 23 March 2020].
8.
Ncbi.nlm.nih.gov. 2020. SARS-Cov-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) Sequences. [online] Disponible aquí [Accessed 23 March 2020].
9.
Gonz√°lez-Wevar C, Salinas P, H√ľne M, Segovia N, Vargas-Chacoff L, Oda E, Poulin E, Contrasting Genetic Structure and Diversity of Galaxias maculatus (Jenyns, 1848) Along the Chilean Coast: Stock Identification for Fishery Management, Journal of Heredity, Volume 106, Issue S1, 2015, Pages 439‚Äď447, doi: 10.1093/jhered/esv005. Disponible aqu√≠.