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PCR, PCR, PCR o cómo detectar SARS-COV-2

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Fecha de Publicación
2020/05/07
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Los virus son las entidades biológicas más pequeñas que existen. Son tan pequeñas que su detección se hace compleja. Afortunadamente, vivimos una época ideal para estudiar microorganismos gracias al avance de técnicas de biología molecular y de secuenciación de ácidos nucleicos (ADN y ARN). Esto ha hecho, por ejemplo, que a mediados de marzo ya haya 174 genomas completos y parciales disponibles del virus SARS-COV-2 (virus que provoca el covid-19) para que los investigadores puedan entender más sobre este nueva cepa que viene causando estragos a nivel mundial (8).
Uno de los aspectos más importantes para poder «aplanar la curva» es detectar quienes están enfermos. Para ello, el Instituto de Salud Pública (ISP) es el organismo oficial que valida y determina la existencia del virus en las personas enfermas. Existen decenas centros de salud donde se realiza el examen (7), pero esta cantidad de centros autorizados para realizar diagnósticos debe aumentar de acuerdo con la demanda para realizar el diagnóstico de covid-19, sumándose distintas Universidades del país.
El examen que se realiza se llama RT-Q-PCR, una sigla rara que explicaremos a continuación:
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una de las técnicas de biología molecular más utilizadas desde su establecimiento en 1986 por Kary Mullis (1). Por este descubrimiento recibió el Premio Nobel de Química en 1993 (2). Esta técnica ya ha sido mencionada en nuestro post llamado “¿Qué tan grande es tu genoma?” (si quieren ver más aplicaciones entre las tantas que tiene hoy en día). El objetivo de la técnica de PCR es recrear el proceso de replicación del ADN, pero in vitro. Es decir, realizar muchas copias de una secuencia de ADN (o tantas veces como sea necesario) para poder detectar su presencia, pero usando reactivos y equipos de laboratorio en lugar de una maquinaria celular (no nos referimos a su teléfono, obvio). Todas estas reacciones se realizan en tubitos minúsculos donde los investigadores manipulan volúmenes muy pequeños (la unidad es microlitro, es decir 0.000001 litros) de materiales como DNA (o RNA), enzimas, nucleótidos, agua y otros con pipetas de precisión especiales para manejar tales cantidades (micropipetas).
Como ya mencionamos, esta técnica permite incrementar la cantidad de copias de un material genético específico para análisis posteriores. El (o ‘la’) PCR aplicado a microorganismos (virus, bacterias, arqueas, hongos) se utiliza con bastantes fines, entre ellos saber si hay bacterias viviendo en los volcanes o identificar algunos patógenos virales (3). También se usa para comparar procesos históricos de estructura genética, o para estimar niveles de flujo genético contemporáneo en animales y plantas (9). Para que vea su versatilidad.
Una de las características más importantes de esta técnica, es que no se necesitan grandes cantidades de material genético para obtener resultados confiables en cualquiera de sus aplicaciones, lo que significa que podemos trabajar con una pequeña muestra (yay!).
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Fuente: GIPHY

¿Entonces en qué se diferencia con otras siglas que se abrevian PCR?

Hay un examen médico muy común conocido también como PCR, cuya sigla es Proteína C Reactiva que en medicina se utiliza como marcador de inflamación no específico (4). También se usa para abreviar paro cardiorrespiratorio.

Pero si el SARS-CoV-2 es un virus de ARN, entonces ¿cómo se realiza este test?

Si. El material genético de SARS-CoV-2 está compuesto de ARN. Para su análisis se requiere primero ‘extraer’ esta molécula desde el virus, para lo cual se usan reactivos químicos específicos, en un proceso largo y a veces tedioso (a menos que lo haga un robot) que implica romper esta capa de grasa (lípidos) que recubre la célula viral para acceder a la molécula de ARN, lavarla e intentar que quede lo más pura posible. Esto, además debe hacerse con mucho cuidado porque el ARN se degrada fácilmente fuera del virus sin contar que la persona que está ejecutando la técnica está expuesta directamente al él. (Nadie dijo que esto fuera fácil). En la actualidad existen muchos ‘kits’ comerciales que permiten hacer este proceso más rápido, pero elevan los costos. Una cosa por otra.
Una vez que se obtiene ARN del virus, este debe transcribirse en ADN mediante un proceso llamado transcripción inversa o retrotransmisión (Pa' los amigos, pasar de ARN a ADN). Esto, ya que la enzima clave para la reacción de PCR (ADN polimerasa) requiere usar como ‘templado’ (molde) ADN en vez de ARN.
Esto se logra gracias al uso de una enzima llamada «Transcriptasa Reversa (o inversa)» (¡descubierta en virus!), la que tiene como función sintetizar ADN a partir de una molécula de ARN (5) como la del virus SARS-CoV-2. Es por eso que el examen incluye la sigla ‘RT’ (del inglés reverse transcription). Luego de obtenido este ADN, se pasa a la etapa siguiente que es el PCR propiamente tal.
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Para llevar a cabo esta reacción se utilizan los mismos componentes que usa la célula para replicar ADN. En este caso, es una mezcla de reactivos entre los que destacamos los siguientes:
Una enzima ADN polimerasa bacana que es capaz de trabajar de forma estable a altas temperaturas (que se obtuvo desde una bacteria termófila aislada desde ambientes termales en el Parque Nacional Yellowstone), permitiendo que los distintos nucleótidos (ACGT) se vayan «pegando» a su base complementaria en la reacción para poder replicar (o copiar) esta molécula muchas veces. Esto se llama amplificar el ADN.
Los partidores, cebadores o primers en inglés, que son  secuencias de ADN cortas que se unen de manera complementaria a un segmento de ADN que se quiere detectar. Este punto es fundamental: es necesario conocer la secuencia del ARN del virus (su genoma) para poder diseñar los partidores específicos para que solo detecten este virus y ningún otro. Así de sensible debe ser para estos fines. Como decíamos al principio, esa secuencia ya existe y todo gracias a la colaboración mundial entre científicos. Recalcamos esto, porque no siempre es así, depende del objetivo del estudio. Además, hay algunos llamados partidores “universales” que amplifican una secuencia objetivo en una gran diversidad de organismos, pero esa es harina de otro costal.
Finalmente, para que el test sea aún más específico, se usa una sonda, que es un pedazo corto de ADN que sólo se puede pegar a la secuencia específica que se está amplificando. La sonda tiene una molécula que puede brillar y otra que le impide brillar. Cuando la polimerasa incorpora a la sonda en la nueva molécula de ADN, se libera el agente que permite brillar y que empieza a emitir luz fluorescente (6) y el tubito «¡brilla!». Si este brilla, lo que quiere decir es que en esa muestra hay ADN viral de SARS-CoV-2  específicamente. Y, por lo tanto, el examen es positivo.
El PCR y el RT-PCR han sido muy útiles para el estudio de virus que generan enfermedades infecciosas, sobretodo en el diagnóstico de virus nuevos o emergentes como SARS-CoV-2 (6). Los aspectos teóricos generales del PCR son bastante simples. Antiguamente, incluso se hacían experimentos de PCR simplemente cambiando el tubito con los reactivos de un recipiente termorregulado a otro de temperatura distintas.
El primer paso de la reacción consiste en separar las dos hebras de ADN (o desnaturalizar las proteínas, si usted es un ñoño sin remedio) y eso ocurre in vitro (en un tubito) a altas temperaturas. Los dos pasos siguientes son a temperaturas un poco más bajas, pero aún muy superiores a la temperatura del cuerpo, para que el ADN se quede estiradito, los partidores o cebadores encuentren y se «peguen» a su secuencia objetivo y permita a la polimerasa copiar rápidamente agregando nucleótidos como una campeona. Por eso usamos la polimerasa sacada de bacterias que vivirían felices en los géiseres del Tatio (Taq polimerasa, desde una bacteria llamada Thermophilus aquaticus).
Los equipos que permiten hace el PCR se llaman termocicladores, un nombre complejo para un equipo que en la práctica, su función principal es solo cambiar la temperatura del tubito con los reactivos, pero de manera muy rápida y controlada.
Los termocicladores más modernos que se usan para diagnosticar covid-19 detectan luz y se pueden programar. Acá describimos como ejemplo un programa para detectar SARS-CoV-2.

EN RESUMEN (Si se quiere lucir en su almuerzo online del domingo)

Primera Etapa:
Usar la transcriptasa reversa para transformar el ARN a ADN (RT) por 15 minutos, seguido de temperatura alta (95 C por 2 minutos) para separar y estirar las moléculas de ADN. Luego el programa repite un mismo ciclo que tiene dos pasos:
Segunda etapa:
1.
Temperatura alta (95 C por 2 minutos) para separar y estirar las nuevas moléculas de ADN que se van formando.
2.
Temperatura para que los partidores se «peguen» a su secuencia objetivo enzima polimerasa trabaje sintetizando o replicando nuevo ADN (50-60º C por 55 segundos). A esta temperatura se pegan los partidores específicos para SARS-CoV-2 que luego guían a la polimerasa y se pega la sonda específica para SARS-CoV-2.
Cuando se termina el ciclo de temperaturas de la segunda etapa, se empieza de nuevo (por eso es un «termo-ciclador»).
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Cada vez que se repite este ciclo se genera más ADN y mas sonda «brillante» que se puede medir a medida que se acumula. Cuando una muestra tiene poco ADN, la luz se demora más en ser suficiente para ser medida, por el contrario, en una muestra con mucho ADN (que viene de un paciente con mucha carga viral, por ejemplo) la luz se genera más rápido. De esta manera podemos cuantificar el ADN y por eso en la sigla aparece la Q (por «quantitative» en inglés) porque la luz es proporcional al número de copias del gen de interés, y se puede obtener además un número estimado de las partículas virales presentes en el paciente.  Los protocolos específicos para realizar esta reacción para detectar SARS-CoV-2 están disponibles públicamente.
La reacción es tan específica para el virus, que si se puede detectar luz, la muestra analizada se considera positiva para SARS-CoV-2.
Por el momento es la forma más certera de diagnosticar covid-19 y la recomendada por la Organización Mundial de la Salud.
Así que ya sabe: detectar la presencia de este virus no es cosa de poner una gotita de muestra y esperar a que una tira de papel cambie de color. Hay que ir a mirar su molécula y encontrarle el parecido a las fotos del genoma bajo el texto «se busca», del escurridizo SARS-CoV2.
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Bonus Track

Busque los errores de este texto:
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Esta es una declaración de una autoridad de cuyo nombre no queremos acordarnos.
Solución de la sopa de letras (o Ud. no lo diga)
1.
No se dice que el gen del virus es positivo: se dice que se detectó la presencia del genoma viral o simplemente que el test es positivo
2.
No es correcto decir que se cultiva el gen: diga mejor que se amplificó el gen.
3.
Gen inactivo: no hay genes inactivos, hay virus activos o inactivos. Aunque tiene razón que el test no dice si el virus está activo (que puede infectar) o no, solo detecta que hay RNA de virus en la muestra.  Para saber si un virus está activo se puede cultivar (y de acá debe venir la confusión), pero ese es un proceso largo y técnicamente difícil que no se puede usar con el número de contagiados por SARS-CoV2. Es mejor asumir que un test positivo indica que la persona aún puede contagiar. Recordemos que un PCR para detectar SARS-CoV2, usa secuencias específicas del genoma viral, por lo que sólo detectará la presencia de este virus en específico y no otro.
Y recuerden, lávense las manos, mantenga su distancia social, intente quedarse en casa lo más que pueda. Es un consejo de tus amigues de Etilmercurio

Referencias

1.
Mullis, K., Faloona, F., Scharf, S., Saiki, R., Horn, G., & Erlich, H. (1986). Specific Enzymatic Amplification of DNA In Vitro: The Polymerase Chain Reaction. Cold Spring Harbor Symposia On Quantitative Biology, 51(0), 263-273. doi: 10.1101/sqb.1986.051.01.032 Disponible aquí.
2.
The Nobel Prize in Chemistry 1993. (2020). Retrieved 19 March 2020, Disponible aquí.
3.
Clinical Application of Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction for HIV Infection Holodniy, Mark, Clinics in Laboratory Medicine, Volume 14, Issue 2, 335 - 349 Disponible aquí.
4.
Pepys, M., & Hirschfield, G. (2003). C-reactive protein: a critical update. Journal Of Clinical Investigation, 112(2), 299-299. doi: 10.1172/jci18921c1. Disponible aquí.
5.
Bustin, S. (2000). Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. Journal Of Molecular Endocrinology, 25(2), 169-193. doi: 10.1677/jme.0.0250169 Disponible aquí.
6.
Mackay, I. (2002). Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Research, 30(6), 1292-1305. doi: 10.1093/nar/30.6.1292 Disponible aquí.
7.
Carvallo, C., 2020. Cómo Es El Procedimiento Y Protocolo Del ISP Para Detectar Casos De Coronavirus En Chile | Emol.Com. [online] Emol. Disponible aquí [Accessed 23 March 2020].
8.
Ncbi.nlm.nih.gov. 2020. SARS-Cov-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) Sequences. [online] Disponible aquí [Accessed 23 March 2020].
9.
González-Wevar C, Salinas P, Hüne M, Segovia N, Vargas-Chacoff L, Oda E, Poulin E, Contrasting Genetic Structure and Diversity of Galaxias maculatus (Jenyns, 1848) Along the Chilean Coast: Stock Identification for Fishery Management, Journal of Heredity, Volume 106, Issue S1, 2015, Pages 439–447, doi: 10.1093/jhered/esv005. Disponible aquí.